IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactosidum) est analogum substrati β-galactosidasis, quod est valde inducibile. Sub inductione IPTG, inductor potest complexum cum proteino repressore formare, ita ut conformatio proteini repressoris mutetur, ita ut non possit cum gene scopo coniungi, et gen scopum efficaciter exprimatur. Quomodo igitur concentratio IPTG per experimentum determinanda est? Quo maior eo melior?
Primum, principium inductionis IPTG intellegamus: operon (elementum) lactosii E. coli tria gena structuralia, Z, Y, et A, continet, quae β-galactosidasam, permeasam, et acetyltransferasam respective codificant. lacZ lactosum in glucosum et galactosam, vel in allo-lactosam, hydrolyzat; lacY lactosum in ambitu per membranam cellularem transire et cellulam intrare sinit; lacA gregem acetylicum ab acetyl-CoA ad β-galactosidum transfert, quod effectum toxicum removet. Praeterea, sequentia operans O, sequentia initialis P, et gen regulatorium I exstant. Codificatio geni I est proteina repressor quae positioni O sequentiae operantis ligare potest, ita ut operon (meta) reprimatur et inactivetur. Locus ligationis pro proteina activatoris geni catabolici - situ ligationis CAP - ante sequentiam initialem P exstat. Sequentia P, sequentia O, et situs ligationis CAP simul regionem regulatoriam operonis lac constituunt. Gena codificantia trium enzymorum ab eadem regione regulatoria regulantur ad expressionem coordinatam productorum genicorum efficiendam.
Lactosa absente, operon (meta) lac in statu repressionis est. Hoc tempore, repressor lac, a sequentia I sub imperio sequentiae promotoris PI expressus, sequentiae O se iungit, quod RNA polymerasem ne sequentiae P se iungatur prohibet et initium transcriptionis inhibet; lactosa praesente, operon (meta) lac induci potest. In hoc systemate operonis (meta), verus inductor non est lactosa ipsa. Lactosa cellulam intrat et a β-galactosidasa catalyzatur ut in allolactosam convertatur. Haec, ut molecula inductor, proteino repressoris se iungit et conformationem proteini mutat, quod ad dissociationem proteini repressoris a sequentia O et transcriptione ducit. Isopropylthiogalactosidum (IPTG) eundem effectum ac allolactosam habet. Inductor potentissimus est, qui a bacteriis non metabolizatur et stabilis est, ita late in laboratoriis adhibetur.
Quomodo optimam concentrationem IPTG determinare? Exempli gratia, E. coli sumatur.
Stirps *E. coli* BL21 genetice modificata, continens pGEX recombinantem positivum (CGRP/msCT), in medium liquidum LB continentem 50μg·mL-1 Amp inoculata est, et per noctem ad 37°C culta. Cultura supradicta in decem ampullas 50mL medii liquidi LB recentis continentis 50μg·mL-1 Amp, proportione 1:100 ad culturam expansivam inoculata est, et cum valor OD600 0.6~0.8 esset, IPTG ad concentrationem finalem additum est. Haec est 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Post inductionem eadem temperatura eodemque tempore, 1 mL solutionis bacterialis ex ea extractum est, et cellulae bacteriales centrifugatione collectae et SDS-PAGE subiectae sunt ad analysin effectus diversarum concentrationum IPTG in expressionem proteinorum, deinde concentratio IPTG cum maxima expressione proteinorum eligenda.
Post experimenta, invenietur concentrationem IPTG non esse quam maximam. Hoc quia IPTG toxicitatem quandam in bacteria habet. Superata concentratione cellulam etiam interficiet; et generaliter loquendo, speramus quo magis proteinum solubile in cellula expressum est, eo melius, sed saepe cum concentratio IPTG nimis alta est, magna copia inclusionis formabitur. In corpore, sed quantitas proteini solubilis minuitur. Ergo, aptissima concentratio IPTG saepe non est quo maior eo melius, sed quo minor concentratio.
Propositum inductionis et culturae stirpium genetice modificatarum est augere proventum proteini destinati et sumptus reducere. Expressio geni destinati non solum a factoribus propriis stirpis et plasmide expressionis afficitur, sed etiam ab aliis condicionibus externis, ut concentratione inductoris, temperatura inductionis et tempore inductionis. Ergo, plerumque, antequam proteinum ignotum exprimitur et purificatur, optimum est tempus inductionis, temperaturam et concentrationem IPTG studere ut condiciones idoneae eligantur et optima experimenta obtineantur.
Tempus publicationis: Decembris XXXI, MMXXI